Studii privind utilizarea tehnicilor de inginerie genetică în vederea îmbunătăţirii proceselor fermentative tradiţionale

Abstract

Obiectivul major al tezei, utilizarea tehnicilor de inginerie genetică pentru îmbunătățirea performanțelor β-glucozidazei izolată de la Saccharomycopsis fibuligera și transferul ei la drojdii din genul Saccharomyces, în vederea eficientizării fermentației substraturilor celobiozice și a celodextrinelor este de mare actualitate și importanță științifică. Pentru atingerea acestui obiectiv major au fost urmărite și concretizate anumite obiective specifice: 1. Construcția și analiza unor gene hibrid STA1/bgl1, clonarea și exprimarea lor în tulpina de laborator Saccharomyces cerevisiae BY4741; 2. Analiza biochimică a enzimelor hibrid obținute prin interschimbul domeniilor noncatalitice: domeniul serină-treonină (STRD) din structura glucoamilazei și domeniul cu structură, β-sandwich, de la capătul carboxil-terminal al β-glucozidazei (domeniul fibronectin-like); 3. Elucidarea funcțiilor biologice ale acestor domenii non-catalitice din structura glucoamilazei și β-glucozidazei; 4. Exprimarea genei codificatoare a enzimei heteroloage, selectată ca având cea mai bună activitate, în diferite tulpini de drojdii industriale; 5. Testarea tulpinilor industriale, obținute prin transformare, în fermentația alcoolică cu substrat celobiozic. Hidroliza enzimatică a celulozei în scopul producerii de bioetanol implică acțiunea unei baterii de enzime, precum: endoglucanaze, celobiohidrolaze și β-glucozidaze. Beta-glucozidazele nu numai că sunt importante în ultima etapă a procesului hidrolitic dar cresc și eficiența procesului, deoarece acumularea celobiozei în cadrul sistemului înhibă acțiunea endoglucanazelor și celobiohidrolazelor. Cu toate că, β-glucozidaza (Bgl1) și glucoamilaza (Sta1) sunt enzime de interes biotehnologic, din punct de vedere funcțional, ele prezintă anumite blocaje care le restricționează potențialul fermentativ. Din punct de vedere structural, glucoamilazele codificate de genele STA ale drojdiei Saccharomyces cerevisiae var. diastaticus sunt proteine care au două domenii: unul amino-terminal, bogat în serină și treonină (STRD) și unul carboxil-terminal, domeniul catalitic, ce are o structură tipică proteinelor familiei 15 a glicozid hidrolazelor. Existența unor domenii similare cu domeniul STRD și în alte proteine extracelulare de la drojdii a condus către ideea implicării acestui domeniu în secreție (Adam și colab., 2004; Latorre Garcia și colab., 2005). Combinând secvențele și datele cristalografice ale exoglucanazelor și β-glucozidazelor din cadrul acestei familii s-a evidențiat faptul că, domeniul catalitic al acestor enzime prezintă la capătul carboxil-terminal o structură de tipul β-sandwich a cărui funcție este încă necunoscută(Pozzo și colab., 2010). De asemenea, Saccharomyces cerevisiae nu poate secreta Bgl1 iar utilizarea acesteia la nivel industrial nu poate fi realizată (Machida și colab., 1988). Astfel, tehnicile biologiei moleculare devin instrumentele care au stat la baza atingerii obiectivelor menționate anterior.